ال تصميم بلازميد لإنتاج أنزيم Pfu بوليميراز معدّل باستخدام قالب pTi والتأكد من تركيبه
الكلمات المفتاحية:
بلازميد، هندسة وراثية، بوليميرازالملخص
يناقش هذا البحث تصميم بلازميد تعبيري لأنزيم Pfu بوليميراز معدَّل ضمن قالب بلازميدي من نوع pTi يُستخدم لأول مرة من أجل هذا الغرض ويحتوي على عدة صفات نوعية تجعله متفوقاً على الأنزيمات التجارية العادية، حيث دُمِجَت شدفات لجزيء Sso7d البروتيني لزيادة ثباتية أنزيم البلمرة من حيث قوة ارتباطه مع التسلسل الهدف للقيام بالتضخيم بسرعة وثباتية عالية.
استُخدم في التصميم البرمجي in-silico عدة قواعد بيانات مفتوحة المصدر، وتم اعتماد منصة Benchling السحابية لتصميم البلازميد والتأكد من فعاليته برمجياً، وبعد التجميع نتج بلازميد تعبيري طوله 7476bp يحتوي على مشغل Lac وجين مقاومة للكانامايسين ومحفز T7 لضمان مردود كبير في التعبير عن الأنزيم الهدف، وتمت إضافة ذيل متعدد الهيستيدين x10His من أجل تسهيل عملية تنقية الأنزيم في المراحل اللاحقة للإنتاج.
وللتأكد من البلازميد في التجارب المخبرية تم تحديد مقاييس للتقطيع الأنزيمي بانزيم HindIII مع محاكاة شكل الرحلان الناتج برمجياً وعمل رحلان فعلي لعينة مُصنَّعة من البلازميد بطريقة غيبسون لمقارنة تطابق النتائج البرمجية مع النتائج الفعلية، بالإضافة إلى ذلك تم تصميم بادئات primers نوعية للقيام بالسَلسَلة وتم التأكد من فعالية جين pfu بوليميراز من خلال عملية السَلسَلة لبعض الشدفات المختارة منه ورُصدت التسلسلات من دون طفرات بالموقع الفعال، ما يجعل هذا البلازميد مرشحاً مقبولاً للاختبار بالعمليات اللاحقة لإنتاج أنزيم Pfu بوليميراز.
